PROSEDUR DAN MEKANISME KLONING

Secara etimologis, kata kloning berasal dari bahasa Yunani "klon" artinya potongan yang digunakan untuk memperbanyak tanaman. Sedangkan secara terminologis, kloning adalah proses pembuatan sejumlah besar sel atau molekul yang seluruhnya identik dengan sel atau molekul asalnya.
Dalam bidang genetika kloning merupakan replikasi segmen DNA tanpa melalui proses seksual (Rekombinasi DNA). Proses ini membuka peluang baru dalam terobosan teknologi untuk mengubah fungsi dan prilaku makhluk hidup sesuai dengan keinginan dan kebutuhan manusia.

Secara teoritis prosedur dan mekanisme kloning terhadap makhluk hidup melalui empat (4) tahap yaitu isolasi fragmen DNA, penyisipan fragmen DNA ke dalam vektor, transformasi dan seleksi hasil kloning.

1) Isolasi fragmen DNA
Isolasi fragmen DNA yang spesifik dapat dilakukan dengan metode PCR (polymerase chain reaction) yaitu teknik amplikasi fragmen DNA yang spesifik secara in vitro. Secara umum DNA yang digunakan untuk PCR adalah total DNA genom yang diekstraksi dari sel dan tidak membutuhkan tingkat kemurnian tinggi. Urutan DNA yang akan diamplikasi secara spesifik akan ditentukan oleh primer-primer yang tersusun dari nukleotida.(1)

Material yang diperlukan untuk proses PCR adalah DNA yang mengandung rangkaian urutan yang akan diperbanyak (duplikasi DNA) yaitu primer, DNA polimerase dan campuran dari empat macam deoksiribonukleotida-trifosfat (dATP, dCTP, dGTP dan dTTP) serta MgCl2.

2) Penyisipan fragmen DNA ke dalam vektor
Proses penyisipan atau penyambungan molekul fragmen DNA dengan molekul DNA vektor disebut ligasi. Biasanya ligasi terjadi antara ujung gugus fosfat dengan gugus hidroksil. Ligasi antara fragmen DNA yang memiliki ujung lengket (cohesive ends) yang komplementer jauh lebih efesien dibandingkan dengan ujung tumpul (blunt ends). Efisiensi ligasi juga dipengaruhi oleh adanya deoksiadenosin tunggal pada ujung. Efisiensi ligasi dapat ditingkatkan, bila fragmen DNA yang memiliki deoksiadenosin tunggal pada ujung bertemu dengan vektor yang memiliki timidin pada ujung.

3) Transformasi DNA
Transformasi adalah proses pemindahan molekul DNA donor dari lingkungan luar sel. Vektor kloning yang merupakan pembawa gen yang akan dikloning ditransformasi ke dalam sel inang. Transformasi dapat dilakukan secara alami maupun buatan. Pada proses transformasi alami, DNA yang berbentuk untai ganda dan memiliki untaian basa spesifik terhadap protein membran masuk ke dalam bakteri melewati membran sel bakteri terhidrolisis. Pada transformasi buatan, sel bakteri dibuat menjadi sel kompeten secara paksa sehingga selubung sel bakteri bersifat permeabel dan memungkinkan DNA dapat berikatan dengan sel dan masuk ke dalam sitoplasma, kemudian berinteraksi dengan genom sel bakteri.(3)

Sel kompeten adalah sel inang yang memiliki kompetensi untuk dimasuki vektor kloning. Perlakuan untuk memasukkan sel kompeten dapat dilakukan dengan menggunakan metode kejutan panas (heat shock) atau kejutan pulsa listrik (metode electroporation).(2)

4) Seleksi hasil kloning
Penyeleksian koloni bakteri untuk mendapatkan kloning yang diinginkan dengan cara X-gal atau pemotongan dengan enzim restriksi. Seleksi dengan X-gal dapat digunakan untuk mengidentifikasi plasmid rekombinan dengan komplementasi. Sedangkan pemotongan dengan enzim restriksi dapat digunakan untuk menyeleksi plasmid rekombinan hasil kloning. Hasil pemotongan tersebut dielektroforesis dan memperlihatkan pita fragmen DNA sisipan yang terpisah dari pita vektor kloning.(4)

Dalam tataran aplikasi, rentetan proses kloning dapat dilakukan dengan mengikuti beberapa langkah berikut ini :
1. Mempersiapkan sel stem, yaitu sel awal yang akan tumbuh menjadi berbagai sel tubuh. Sel ini diperoleh dari makhluk hidup yang hendak dikloning.
2. Sel stem diambil inti selnya yang mengandung informasi genetik kemudian dipisahkan dari sel.
3. Mempersiapkan sel telur, yaitu sebuah sel yang diambil dari makhluk hidup dewasa kemudian intinya dipisahkan.
4. Inti sel dari sel stem diimplimentasikan ke sel telur.
5. Sel telur dipicu supaya terjadi pembelahan dan pertumbuhan. Setelah membelah menjadi embrio.
6. Sel embrio yang terus membelah (blastosis) mulai memisahkan diri dan siap diimplementasikan ke dalam rahim.
7. Embrio tumbuh dalam rahim menjadi janin dengan kode genetik persis sama dengan sel stem donor.(5)

Daftar Bacaan
1. Simbolon, H. Biologi Jilid 3. Jakarta, Penerbit Erlangga, 1994).
2. Sambrook dkk. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. New York, CSHL Press, 1989).
3. Stainer dkk. The Microbial World. New Jersey, Prentice-Hall, 1986).
4. Seno D.S dan E.D. Purwakusumah. Produksi L-iisin oleh Strain Hasil Rekayasa Genetik. Laporan Penelitian pada FMIPA UI 1995 (tidak dipublikasikan).
5. Dikutip dari http://strategis.ic.gc.ca/SSG/tc00026e.html.